Kruk DNA-onderzoek voor de detectie van pancreaskanker Beoordeling van methylatie Marker Kandidaten

Kruk DNA-onderzoek voor de detectie van pancreaskanker Beoordeling van methylatie Marker Kandidaten

Abstract

ACHTERGROND

Alvleesklierkanker (Panc) presenteert in vergevorderd stadium met een hoge sterfte. Effectieve vroegtijdige detectie methoden nodig. Afwijkend gemethyleerde genen onontgonnen als merkers voor invasieve detectie door ontlasting testen. Ons doel was om discriminerende gemethyleerde genen te selecteren en om de nauwkeurigheid van deze en mutant KRAS beoordelen in de ontlasting aan Panc detecteren.

METHODEN

Negen doelwit genen werden getest door middel van real-time methylatie-specifieke PCR (MSP) in bisulfiet behandeld DNA uit gemicrodissecteerde bevroren exemplaren van 24 Panc gevallen en 30 normale colon controles. Gearchiveerd ontlasting van 58 Panc gevallen en 65 controles gematched op geslacht, leeftijd, en roken werden geanalyseerd. Target genen van fecale supernatanten werden verrijkt door hybride-capture, bisulfiet-behandelde, en getest door MSP. KRAS mutaties werden getest met behulp van de kwart-techniek.

RESULTATEN

Conclusies

sleutelwoorden: Vroege opsporing, pancreaskanker, biologische markers, epigenetica, uitwerpselen / analyse, bot morfogenetische eiwit 3, mutant KRAS

Invoering

Pancreas ductaal adenocarcinoom (Panc) blijft de vierde belangrijkste oorzaak van sterfgevallen door kanker in de Verenigde Staten. 1 Patiënten typisch aanwezig met symptomatische, vergevorderd stadium van de ziekte. 2 Onder de minderheid patiënten een operatie, 5 jaars overleving is minder dan 25%; Maar overlevenden vroeg stadium van de ziekte bij resectie. 3. 4 Helaas zijn overlevingskansen iets meer dan de afgelopen decennia veranderd.

Niet-invasieve detectie van de alvleesklier neoplasia is biologisch rationeel en ondersteund door observaties tot nu toe. Alvleesklier kanker en voorlopers exfoliëren in de lokale effluent en uiteindelijk ontlasting. Mutant KRAS kunnen worden gesequenced van de pancreas sap van patiënten met Panc. 12. 13 Onze fractie 14 en 15. 16 anderen hebben aangetoond dat mutant KRAS ontlasting in de aanwezigheid van zowel alvleesklierkanker en voorstadium kunnen reflecteren. Er zijn echter geen enkele mutatie marker heeft een optimale dekking van Panc, en panelen van mutatie markers kan analytisch onhandelbaar voor gebruik in de dagelijkse praktijk.

Afwijkende DNA-methylatie is een ruimer informatieve klasse van kandidaat tumormarkers. Bijvoorbeeld kan een combinatie van slechts 2 gemethyleerde genmerkers perfect discrimineren colorectale kanker en prekanker van normaal mucosa weefsel 17 en dergelijke informatieve methylatie merkers opgenomen in een volgende generatie kruk DNA-test 18 overtreft eerdere tests op basis van analyses van meervoudige puntmutaties . 19. 20 Voor zover ons bekend, gebruik van gemethyleerde markers in ontlasting Panc detecteren is niet gemeld.

Verschillende veelbelovende gemethyleerde gen merkers geïdentificeerd voor Panc en precursoren van weefsel, inclusief MDFI (MyoD familie remmer) en CNTNAP2 (contactine geassocieerd eiwitachtige 2), 21 sFRP2 (afgescheiden op frizzled related protein 2) 22 alleen of in combinatie met UCHL1 ( ubiquitine carboxylterminale esterase L1), 23 en gemethyleerde tissue factor pathway inhibitor 2 (TFPI2). 24 Deze merkers kunnen ook afwijkende gemethyleerd andere kankers. Bijvoorbeeld colorectale weefsel lijkt 17 TFPI2 bijzonder discrimineren met BMP3 (botmorfogeen eiwit 3), NDRG4 (N-myc neerwaarts gereguleerd gen) en vimentine.

Onze hypothese was dat de ontlasting detectie van Panc haalbaar zou moeten zijn met behulp van afwijkend gemethyleerd DNA-merkers. Kandidaat markers zou omvatten die eerder aangetoond dat de alvleesklier en colorectale tumoren te onderscheiden van normaal weefsel. Onze studie doelstellingen waren: 1) select kandidaat methylatie markers voor Panc in het weefsel; 2) bepalen welke markers discrimineren tussen Panc gevallen en normale controles met behulp van aangepaste archivering ontlasting; en 3) de impact van de klinische covariaten op de testprestaties.

Materialen en methodes

studie ontwerp

Dit onderzoek begon op het weefsel niveau met de selectie van kandidaat-methylatiemerkers die Panc te onderscheiden van de normale colon epitheel met behulp van een case-control studie ontwerp op archiefmateriaal monsters (Tissue Study). Sinds onze bedoeling was om kandidaat markers te kiezen voor de ontlasting testen en omdat exfoliatie van normale dikke darm zou in verhouding veel groter dan die van normale pancreas, werden de normale colon (in plaats van de normale pancreas) controles met opzet gekozen om markers waarschijnlijk verhoogde achtergrondconcentratie daarvan in de ontlasting veroorzaken uit te sluiten. We evalueerden markers door anderen naar verluidt discriminant voor pancreas gezwellen (MDFI, CNTNAP2, sFRP2, UCHL1, TFPI2, Vimentin) samen met verscheidene markers die onze fractie heeft gevonden nuttig voor ontlasting detectie van colorectale neoplasie (BMP3, NDRG4, EYA4) maar die nog niet onderzocht bij Panc. De meest gevoelige en specifieke weefselpunten werden geselecteerd voor verdere evaluatie in ontlasting (Kruk Study). Met behulp van archiefmateriaal ontlasting van goed gekarakteriseerd patiënten werden kandidaat markers getest in blinde manier van 58 case patiënten met biopsie bewezen pancreas ductaal adenocarcinoom en vanaf 65 demografisch gematchte controlegroep patiënten met een normale colonoscopie en geen bekende Panc, chronische pancreatitis, alvleesklier deficiëntie of voorafgaand alvleesklier chirurgie. Mutant KRAS werd ook getest in alle ontlasting om aanvullende waarde te schatten. Deze studie werd goedgekeurd door de Mayo Institutional Review Board.

Instellen en Deelnemers

tissue Study

Patiënten hadden distale pancreatectomy, pancreaticoduodenectomie of colectomie ondergaan aan de Mayo Clinic (Rochester, MN) met een gearchiveerd chirurgisch monster en een bevestigde pathologische diagnose. De geïdentificeerde Panc gevallen werden vergeleken met ongeëvenaarde non-neoplastische colonic epitheliale controles die DNA werd geëxtraheerd en opgeslagen door de Mayo Clinic biostalen Accessioning verwerkingslab. Alle deelnemers ondertekende een onderzoek toestemming voor het gebruik van weefselmonsters.

kruk Study

Klinische gegevens werden geabstraheerd van het elektronisch medisch dossier door een ervaren studie coördinator met behulp van een geprotocolleerde collectie vorm. Patiënten werden uitgesloten voor bekende neoplastische ziekte bij een ander luchtweg site; voorafgaande behandeling van kanker met chirurgie, chemotherapie of bestraling; of voor ontlasting verzameld binnen 1 week van orale contrast of darmen catharsis voor diagnostische procedures.

Kruk verwerven en verwerken

Hele ontlasting werden verzameld met behulp van een plastic emmer apparaat gemonteerd op de wc-bril. Na ontlasting patiënten onmiddellijk goot een stabiliserende bufferoplossing 25 op de kruk en de bak afgedicht met een waterdicht deksel. De monsters werden verzameld van patiënten ofwel&# X02019; thuis en express gemaild of uit de ambulante setting en met de verwerking lab geleverd via intra-institutionele koerier systemen. Bij ontvangst in onze centrale verwerkingseenheid laboratorium werden ontlasting onmiddellijk gehomogeniseerd, in monsters verdeeld en ingevroren bij &# X02212; 80C tot assay.

assay Techniek

DNA Extraction in Tissue Study

DNA werd voorheen geëxtraheerd uit bevroren weefsel met een fenol-chloroform protocol en gesuspendeerd in buffer. Kwantificering van totaal DNA werd uitgevoerd met een Nanodrop spectrofotometer (Thermo Scientific, Wilmington, DE)

Real-Time Methylatie Specifieke PCR (MSP) in Tissue Study

DNA werd bisulfiet behandeld met de EZ DNA methylatie Kit (Zymo Research, Orange, CA) en geëlueerd in buffer. een &# X000b5, l bisulfiet-behandelde DNA werd gebruikt als matrijs voor methylering kwantificatie met fluorescentie gebaseerde real-time PCR. Primers voor elke marker zijn ontworpen om de bisulfiet-gemodificeerde gemethyleerde sequenties van elk gen (IDT, Coralville IA) te verkrijgen. Een gebied zonder cytosine-fosfaat-guanine sites in de &# X003b2; actine gen werd ook gekwantificeerd door real-time PCR met behulp van primers herkennen van de bisulfiet geconverteerd sequentie als referentie van bisulfiet behandeling en DNA ingang. PCR-reacties voor weefsel DNA-monsters werden uitgevoerd met SYBR Green master mix (Roche, Duitsland).

Alle reacties werden uitgevoerd op Roche 480 LightCyclers (Indianapolis, IN). Bisulfiet-behandelde CpGenome Universal gemethyleerde DNA (Millipore, Billerica, MA) werd gebruikt als een positieve controle, en serieel verdund standaard curves voor alle platen maken.

Ontlasting werden gewogen en verdund met extra buffer 3 gramequivalenten. Ontlasting werd gecentrifugeerd en het supernatant geïncubeerd met polyvinylpyrrolidon (Crosby &# X00026; Baker, Westport MA) op vaste stoffen en PCR-remmers te verwijderen. Natriumchloride en guanidine thiocyanaat (Sigma, St. Louis MO) denaturatie buffer toegevoegd aan geklaarde supernatant ontlasting en gedenatureerd in een waterbad bij 90 ° C gedurende 10 minuten. 150 &# X000b5; L van carbonzuur gecoate capture kralen met aminozuren geconjugeerd oligonucleotiden complementair aan sequenties (IDT, Coralville IA) richten werden toegevoegd en gemengd om hybridisatie bij kamertemperatuur staan. Monsterbuisjes werden vervolgens op magnetische kralen en supernatant werd verwijderd voor een 3-staps wassen in MOPS-buffer (10 mM MOPS, 150 mM NaCl, pH 7,5) om de resterende inhibitoren te verwijderen. Verwarmd tRNA elutiebuffer toegevoegd en de korrels verwijderd met centrifugatie. Twee multiplex capture reacties van 4 MSP targets en 4 KRAS targets werden apart uitgevoerd.

Marker Testen in Kruk Study

Alle tests werden uitgevoerd door twee onderzoekers (J.B.K. w.r.t.) in overeenstemming met de standard operating procedures opgesteld voor deze technieken in ons laboratorium. Alle reacties werden uitgevoerd op dezelfde twee thermocycler apparaten; Alle DNA-monsters werden verwerkt onder toepassing van dezelfde reagentia. Probes en primers werden getest vóór assay gebruik optimale duur van verwarming en koeling cyclus te bepalen. De kruk studie assays werden uitgevoerd blind voor de klinische diagnose na monsters werden opgehaald door een derde technicus (T.C.Y.). Monsters waarvoor &# X003b2; actine niet versterken tijdens MSP werden uitgesloten. De verblindende code werd gebroken op het moment van analyse.

statistische Overwegingen

tissue Study

De methylering voor elk kandidaat-gen werd gedefinieerd als het absolute kopie aantal gemethyleerd doelsequenties na PCR amplificatie, uitgedrukt als een continue variabele. De primaire benadering van het combineren van de afzonderlijke DNA-merkers in een panel was stapsgewijze logistische regressie met een kans op het model van 0,1 en een waarschijnlijkheid reactie van 0,05 voeren. Met vierentwintig gevallen dertig controlemonsters beschikbaar voor studie, werd het model beperkt tot 3 voorspellende DNA-merkers. Van alle mogelijke drie variabele modellen (in totaal 56 mogelijke modellen) het model met de laagste tot cross foutenmarge werd beschouwd als het optimale model en werd gebruikt om het gebied te schatten onder de ROC-curve (ROC) curve. ROC curves werden ook berekend voor elke afzonderlijke marker. In colorectale kanker, het vermogen van elke afzonderlijke marker voor de detectie van significante afwijkingen varieert van 20% tot 40%. Voor de toepassing van de macht berekening voor de gevoeligheid schattingen van een logistische regressie model, een optimist niveau van 30% werd gebruikt als de nulhypothese waarde voor de opsporing tarief; individueel paneel merker of merkers discriminant beschouwd als de ondergrens van het 95% betrouwbaarheidsinterval voor de geschatte gevoeligheid niet beneden 30% in een tweezijdig vergelijking valt. Vijfentwintig patiënten per stratum ontvangen 80% een echte gevoeligheid van 70% te onderscheiden van 30% met een 2-zijdige twee steekproefproportie test op het 5% niveau.

Ook u kunt bestellen hier.